TU BRAUNSCHWEIG

Grundlagen der Kapillarelektrophorese

Die Elektrophorese ist die Trennung von geladenen Molekülen im Elektrischen Feld. Die Kapillarelektrophorese ist ein elektrophoretisches Trennverfahren, bei dem die Trennung in mit Puffer gefüllten Kapillaren erfolgt. Durch Anlegen von Hochspannung ( 2 - 35 kV ) werden geladene Moleküle auf Grund unterschiedlicher Ladungszahl und Mobilität getrennt (Abbildung 1).


Abb. 1.: Trennung durch Unterschiede in Ladung und Mobilität

Als Trennsäulen werden Quarzglas-Kapillaren verwendet, die als Säulenmaterial aus der GC bekannt sind. In Abbildung 2 ist der schematische Aufbau einer Kapillar-Elektrophorese-Einheit dargestellt.


Abb. 2.: schematisierte Meßapparatur für die Kapillarelektrophorese

Während der Trennung wird die eingesetzte Elektrische Leistung in Joulesche Wärme umgesetzt (übliche Stromstärken: 1-200μA, umgesetzte Elektrische Leistung: bis zu 7 W). Dadurch werden die Pufferflüssigkeit und die Kapillare aufgeheizt. Die Joulesche Wärme muß möglichst effizient abgeleitet werden. Deshalb werden Kapillaren mit kleinem Innendurchmesser und daher hohem Oberflächen-VolumenVerhältnis verwendet. Durch den Einsatz englumiger Kapillaren werden gleichzeitig Radialdiffusion und Konvektion vermindert.

Die photometrische Detektion, meist im UV-Bereich, ist das am häufigsten angewandte Prinzip in der Kapillarelektrophorese. Dazu wird die Quarzglaskapillare im Strahlengang justiert und dient selbst als Küvette.

Zur Durchführung einer Trennung wird zunächst die Kapillare mit Puffer gefüllt. Anschließend wird eines der Puffergefäße (Abb. 2) gegen ein Probengefäß ausgetauscht (Abb.3). Die Probe wird hydrodynamisch durch Druckunterschiede oder elektrokinetisch durch kurzzeitiges Anlegen von Hochspannung in das Kapillarende gebracht. Die Probenzone ist üblicherweise wenige Millimeter lang. Zu Beginn der Trennung taucht das Kapillarende wieder in Puffer, so daß die elektrophoretische Trennung aus der injizierten Probenzone erfolgen kann.


Abb. 3: Probeninjektion in der CE

Bei pH-Werten über 2.5 entsteht ein Fluß, der die Wanderung im elektrischen Feld überlagert. Die meisten Moleküle wandern dann in eine einheitliche Richtung, selbst Anionen wandern in Richtung Kathode ( vgl. Abb. 4 ). Dadurch gelingt es, die meisten Probenmoleküle vom Kapillarbeginn in Richtung Kathode durch die Detektionszelle wandern zu lassen. Der Elektro-Endoosmotische Fluß (EOF) entsteht, weil die Silanol-Gruppen von unbeschichtetem Quarzglas bei höheren pH-Werten teilweise deprotoniert werden und dann negativ geladen sind. Da die Trennkapillare insgesamt elektrisch neutral ist, existiert in der Pufferlösung ein Überschuß an Kationen. Diese reichern sich an den negativ geladenen Kapillarinnenflächen an. Wird eine Spannung angelegt, dann wandern diese Kationen zur Kathode und ziehen durch ihre Solvathüllen die gesamte Pufferlösung mit (Abb. 4). Da sowohl die treibende Kraft des Flusses als auch die Reibung von den Kapillarwänden ausgeht, resultiert ein sehr flaches Strömungsprofil (Abb. 5). Eine Peakverbreiterung durch Radialdiffusion kann daher nicht auftreten.


Abb. 4: Entstehung des elektroosmotischen Flusses (EOF)

Abb. 5: Entstehung von Strömungsprofilen.

Wird die Strömung durch eine Druckdifferenz verursacht, dann bildet sich nach kurzer Zeit durch Reibung an der Kapillarwand ein parabolisches Strömungsprofil aus (HPLC);

Beim elektroendoosmotischen Fluß ( EOF ) entsteht die treibende Kraft an der Kapillarwand. Nach kurzer Zeit halten sich diese Kraft und die Reibung die Waage. Ein flaches Strömungsprofil entsteht (CE)

Die Kapillarelektrophorese wird häufig mit der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) verglichen. Durch den gerichteten Fluß und die photometrische Detektion sehen Chromatogramme und Elektropherogramme ähnlich aus, obwohl die Trennprinzipien verschieden sind. Die Trennleistung ist generell in der CE höher, da in der HPLC zusätzliche Peakverbreiterung durch das parabole Strömungsprofil und die Verteilungsvorgänge beobachtet wird.

Außerdem kann in der CE durch Probenfokussierung (engl.: stacking) in vielen Fällen die Trennleistung erhöht werden. Die Elektrische Feldstärke ist umgekehrt proportional zur Leitfähigkeit. Häufig ist die Leitfähigkeit der Probenzone geringer als die des Puffers, besonders wenn wäßrige Lösungen der Analysensubstanzen injiziert werden. In diesen Fällen ist die Elektrische Feldstärke zu Beginn der Trennung in der Probenzone höher als im Puffer. Durch die hohe Feldstärke werden die Probenmoleküle in Richtung der Grenzschicht Probenzone/Puffer beschleunigt. Sobald sie diese Grenzschicht erreicht haben, wandern sie im geringeren Elektrischen Feld der Pufferlösung wesentlich langsamer weiter, so daß die Probenmoleküle an dieser Grenzschicht angereichert oder fokussiert werden.

Ein chromatographisches Trennprinzip wird in der CE genutzt, um auch ungeladene Moleküle trennen zu können. Bei der Mizellaren Elektrokinetischen Kapillar-Chromatographie (MEKC) werden zunächst Mizellen gebildet (Abb. 6), indem dem Puffer oberflächenaktive Substanzen in Konzentrationen oberhalb der Kritischen Mizellbildungskonzentration (CMC; engl.: critical micelle concentration) zugesetzt werden. Diese Mizellen wandern im endoosmotischen Fluß zur Kathode, durch ihre negative Ladung jedoch langsamer als der Laufpuffer. Moleküle verteilen sich nach ihrer Lipophilie in- und außerhalb der Mizellen. Verschiedene Moleküle werden durch unterschiedliche Affinität zu den Mizellen getrennt. Es findet Retention in der verlangsamten, als pseudostationär bezeichneten mizellaren Phase statt.


Abb. 6: Mizellare Elektrokinetische Kapillar-Chromatographie

(MEKC): Negativ geladene Mizellen wandern durch den endoosmotischen Fluß m in Richtung Kathode, werden aber durch ihre Elektromigration m in Richtung Anode gebremst. Ihre Netto-Bewegung ist im Vergleich zum endoosmotischen Fluß stark vermindert. Substratmoleküle S können durch verschiedene Affinitäten zu den Mizellen getrennt werden.


  aktualisiert am 29.10.2014
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