Die wesentlichen Ziele des Zentralen Projektes im DFG-Schwerpunktprogramm 1934 DiSPBiotech bestehen darin, spezielle Herstellungs- und Aufreinigungsprotokolle für unterschiedliche Protein ß-Lactoglobulin Bovin (BlgB)-Varianten über systematische Scouting-Programme im µL- bis mL-Maßstab zu entwickeln, die im größeren Maßstab hergestellt, aufgereinigt und anderen SPP-Arbeitsgruppen für vergleichende Untersuchungen bereitgestellt werden.
Da eine Reihe von SPP-Projekten BlgB für ihre Untersuchungen nutzen, wird sich im Rahmen der hier durchgeführten Untersuchungen vorrangig mit der Herstellung neuer BlgB-Varianten, dem Vergleich zu nativem BlgB und des bisher rekombinant hergestellten BlgB-Wildtyps, auseinandergesetzt. Neben einzelnen Aminosäureaustauschen im aktiven Zentrum und auf der Oberfläche werden Disulfidbrücken erzeugt oder entfernt. Darüber hinaus erfolgt die Produktion einzelner Domänen und ganzer Proteinteile. Versuche mit diesen veränderten Proteinen werden Auskunft über den Einfluss der Struktur auf die Aggregationsneigung und Scherfestigkeit geben. Für diese Versuche zur Bereitstellung neuer BlgB-Varianten müssen neben den molekularbiologischen Arbeiten die Herstellungs- und Aufarbeitungsstrategien neu entwickelt bzw. sukzessive angepasst werden. So werden im Mikrotiterplatten-Maßstab im High-Throughput-Verfahren die jeweiligen Kultivierungsparameter ermittelt und ein Scale up durchgeführt. Auch im Bereich der Aufreinigung und der Formulierung werden die bisher im kleinen Maßstab etablierten Protokolle für die verschiedenen Mutanten und Varianten verändert und auf die Aufreinigung größerer Mengen übertragen. Eine besondere Herausforderung stellen hierbei die zu erwartenden intrazellulären, unlöslichen Proteinaggregate dar.
Projektverantwortliche: Sarah Brune, Elena Kempf
Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die finanzielle Unterstützung des " Zentrales Projekt – Teilprojektübergreifende Herstellung und Charakterisierung von Modellproteinen" im Rahmen des DFG Schwerpunktprogramms DiSPBiotech (SPP 1934).
